清华新闻网7月22日电 哺乳动物器官的功能来自介观尺度大量细胞和细胞器在时空中的迁移、相互作用与协同。许多免疫事件既表现为器官范围内的群体行为，也伴随细胞形态和细胞器活动的快速变化；这些过程往往短暂、稀有且难以在体外完整复现。因此，理想的活体成像技术既要“看得广”，覆盖毫米级组织范围，又要“看得细”，分辨亚细胞结构，还要足够快、足够温和，才能长时间记录自然状态下的动态。实现这一目标的核心障碍是高数值孔径（NA）条件下的系统性权衡：高NA有利于提升集光能力和空间分辨率，却也会加剧像差敏感性、缩短景深并引入更强的背景荧光；传统逐层扫描还可能增加光毒性。现有高NA物镜通常难以在大视野内同时保持均匀分辨率，这使器官尺度的亚细胞动态长期缺少合适的观察工具。
清华大学自动化系戴琼海院士、吴嘉敏副教授团队与华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科王伟教授团队合作研制出多维多尺度计算摄像仪器RUSH3D-HR，它具有1.05高数值孔径的介观共聚焦体积显微，达到了约390nm横向分辨率，700nm轴向分辨率，单次曝光下成像体积达2.7×2.0×0.04 mm3。其成像速率高达每秒5次体积成像，同时具有低光毒性。
图1.昆仑物镜与RUSH3D-HR示意图
团队特别设计了具有高横向空间带宽积的昆仑物镜，在2.8毫米视场范围内将数值孔径扩展至1.05，实现了相同数值孔径下高一个数量级的横向空间带宽积，并采用数字自适应波前光学系统（wDAO）校正像差，解决了高数值孔径下像差敏感问题；应用扫描光场显微框架，实现了并行高速低光毒性体积成像；使用了线共聚焦技术，在40微米的轴向覆盖内实现了强大的光学切片和背景抑制能力，解决了高数值孔径光学下浅景深问题。
此外，为了应对介观成像下高达70B体素每秒的数据通量，团队自主研发了基于深度学习的并行计算成像处理管线，实现了去噪、多点像差矫正、运动伪影去除和三维重建全流程。
RUSH3D-HR能够同时观察跨越细胞器、单细胞与器官尺度的动态过程。研究团队利用该系统追踪小鼠伤口愈合中的长距离集体迁移，捕捉急性肝衰竭中的罕见迁移体事件及免疫细胞相互作用，并在活体脾脏中发现炎症相关的中性粒细胞瞬态群聚。进一步地，团队以这一群聚行为作为介观炎症生物标志物，直接评估了足三里电针的抗炎效应。
图2.RUSH3D-HR对小鼠背部皮肤伤口愈合连续10小时的成像
研究团队通过局部去除小鼠背部表皮造成轻微真皮损伤，并利用自动对焦对先天免疫反应连续成像超过10小时。对数千个细胞的轨迹分析显示，免疫细胞会集体向伤口方向进行长距离迁移，中性粒细胞还会穿行于真皮脂肪组织的基质间隙，形成网状迁移路径。部分细胞在抵达伤口前停止并聚集，提示伤口周围可能存在零星的局部炎症灶。得益于亚细胞分辨率，RUSH3D-HR还清晰观察到中性粒细胞团聚过程中每个细胞的运动轨迹与形态变化。
图3.利用RUSH3D-HR对小鼠肝功能衰竭的罕见迁移体事件进行定量研究
在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝衰竭模型中，RUSH3D-HR以毫米级视野和亚细胞分辨率同时观察中性粒细胞、巨噬细胞与血管。迁移体是迁移细胞在回缩纤维上形成的细胞器，由于产生概率低、出现位置随机，传统活体显微镜往往需要多次重复实验才能捕获。而RUSH3D-HR使这类稀有事件在单次实验中变得可常规观察，可以显著提高实验效率，并有望减少所需实验动物数量。
RUSH3D-HR观测到的定量结果显示，在50分钟高速成像期间，APAP处理小鼠肝脏中的迁移体累积生成量约为对照组的6倍。团队还直接记录到中性粒细胞产生的迁移体被其他中性粒细胞或巨噬细胞吞噬的动态过程。这些结果提示，迁移体在病理应激下可能参与免疫细胞间的信息交流，但其具体功能仍需进一步研究。
图4.利用RUSH3D-HR观察小鼠脾脏炎症下大规模瞬态团聚现象
生物体疾病进展的早期阶段源于器官内细微的细胞变化，其中复杂的亚细胞动力学与大规模群体层面的行为相互协调。在炎症信号刺激下，中性粒细胞会发生集体性、短暂的团聚现象。此类涌现行为对于快速免疫应答至关重要，但此前由于技术限制，科研人员无法在哺乳动物脾脏内进行观测，而研究团队首次利用RUSH3D-HR在活体中大量捕捉到这一现象。
在脂多糖刺激下的小鼠脾脏内，研究团队对宽2.8毫米的区域内高达6000个中性粒细胞进行追踪，发现炎症环境下发生的团聚现象是正常生理环境下的近10倍。
针灸等中医外治法通常涉及多细胞参与、跨尺度调控和远端器官响应，其作用过程具有明显的时空动态性，而单一分子指标或实验终点往往只能呈现干预后的局部结果难以完整反映免疫细胞如何在器官范围内协同响应。RUSH3D-HR能够同时追踪数千个细胞并解析单个细胞的亚细胞状态，为研究中医干预如何重塑器官尺度的集体生物学行为提供新的观察窗口。
此前的研究显示，对足三里穴位进行电针刺激可能调节远端部位的生理功能，并在脓毒症等疾病中发挥抗炎作用。研究团队使用RUSH3D-HR对接受足三里电针治疗后的小鼠脾脏进行成像：LPS注射2.5小时后，研究人员以0.5mA对足三里进行电刺激，并在3小时后观测。结果显示，与LPS组和仅进针但不通电的0mA对照组相比，0.5mA电针组的群聚事件减少5倍以上，仅进针而不施加电刺激并未产生同样效果。这一结果为足三里电针调节外周免疫反应提供了器官尺度、活体动态的直接影像学证据。
图5.利用介观生物指示物验证足三里电针对于早期脾脏炎症的抑制作用
与传统主要依赖症状、血液指标、组织学或终点分子检测的评价方式不同，RUSH3D-HR能够在干预后数小时内连续追踪免疫反应的发生、发展和消退，使研究者不仅能够判断干预“是否有效”，还能够进一步观察“何时起效、哪些细胞响应、群体行为如何改变”。RUSH3D-HR有望推动中医药研究从经验性疗效描述走向可重复的活体证据：不仅评价一种干预是否产生效应，还可比较不同穴位、刺激强度、频率和治疗时程所引发的细胞响应差异，并识别能够反映治疗效果的动态生物标志物。
研究成果以“高数值孔径介观共聚焦成像揭示活体内跨尺度亚细胞动态过程”（High numerical aperture confocal volumetric mesoscope reveals mesoscale subcellular dynamics in vivo）为题，于7月15日发表在《自然·生物技术》（Nature Biotechnology）期刊上。
清华大学心理系助理教授卢志、华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科教授汪明欢、复旦大学未来信息创新学院博士生陈文韬为论文共同第一作者，戴琼海、吴嘉敏、王伟为共同通讯作者。复旦大学未来信息创新学院博士生金满昌、王添运，清华大学自动化系助理研究员朱来余、张琦，浙江荷湖科技有限公司杨懿、庄超玮参与研究并作出重要贡献。
该工作得到了国家自然科学基金、北京市自然科学基金、科技部重点研发计划、清华-福州联合数据技术研究中心、国家博士后创新人才支持计划、中国博士后科学基金、清华水木学者项目、清华大学-北京大学生命科学联合中心的支持。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-026-03231-z
供稿：自动化系
编辑：贠尔茹 李华山
审核：黄思南
