清华学生攻坚结构生物学难题
 
来源:科技日报 2010-10-19

  以党尚宇、孙林峰、黄永鉴三位清华学生为主力的课题组,在清华大学医学院教授颜宁的带领下,用了一年半的时间,在世界上首次解析了膜蛋白——大肠杆菌岩藻糖转运蛋白的结构,并结合生化手段初步揭示了其工作机理。顶级学术期刊《自然》在10月7日刊发了他们的学术论文《岩藻糖转运蛋白向胞外开放构象的结构》。

  膜蛋白的结构生物学研究一直以来是结构生物学领域公认的重点及难点。而该论文的前两位作者党尚宇和孙林峰在开始课题研究的时候还都是清华大学的本科生。

  初生牛犊不惧虎——本科生接手结构生物学世界难题

  膜蛋白存在于细胞的细胞膜上,它们是沟通细胞或细胞器内外的桥梁。各种营养物质的运输,细胞内有毒物质的排出,以及细胞内外信息的交换都要依靠膜蛋白,所以它们的功能在生命体中至关重要。但是由于膜蛋白不溶于水,难以纯化出均一性较好的蛋白质,也就比较难得到高质量的蛋白质晶体,故研究起来困难重重。

  1985年,第一个膜蛋白结构问世,当时共计仅有不到200个生物大分子结构。而时至今日,蛋白结构数据库收录的近7万个生物大分子结构中,膜蛋白结构仅不到700个,其中新型的膜蛋白结构又只有250多个,足见膜蛋白结构生物学研究的困难。

  2008年3月,还是一名大三学生的党尚宇,在本科生进实验室进行科研训练的时候,选择了施一公教授领导的清华大学结构生物学研究中心,并进入了颜宁教授负责的实验室进行科研工作。凭着对科研的热爱和刻苦钻研的精神,党尚宇在不到半年的时间里就掌握了基本的实验技能。

  2008年8月,当颜宁老师找到党尚宇,与他讨论如何开展科研工作的时候,没有什么科研经验的党尚宇大胆提出自己是否可以尝试承担一项课题,颜宁老师答应了,并将这个膜蛋白的研究课题交给了他。

  为什么敢于将这样一个难题交给一名本科生?颜宁说:“那个时候就想,他们年龄很小,一两年内没什么突破也没有什么心理负担,感觉有点像是我把他们‘骗上船’的。如果做不出来,就算是通过课题培养他们的科学素养、锻炼他们的实验技能了。”

  坚持就是成功——研究膜蛋白就看谁先放弃
 
  然而,要做好膜蛋白的研究工作,不是单单凭借勇气就可以的。

  实验选择大肠杆菌作为培养岩藻糖转运蛋白的生命体。大概的流程如下:

  当培养的大肠杆菌细胞达到一定浓度的时候,向培养基中加入诱导剂,接着在合适的条件下培养一段时间,这个诱导剂会让岩藻糖转运蛋白在细胞内大量的“生产”。然后把大肠杆菌“破碎”,通过离心将细胞膜从中分离出来,再加一点“去污剂”,把岩藻糖转运蛋白从细胞膜上萃取出来,再通过进一步的纯化手段除去蛋白杂质到高纯度的蛋白。

  然后就是结晶——把蛋白溶液分别与含有不同化合物的溶液按照一定比例混合,在适宜的化合物的溶液里面,蛋白就慢慢地有规则的、整齐的排列、聚集在一起,形成了蛋白晶体。

  再用X光对蛋白晶体从不同的角度进行衍射分析,得到一组衍射图像,用软件对这些图形进行分析,再借助一些其他的手段,就可以得出蛋白结构了。
 
  回想起当时的研究工作,党尚宇说:“每前进一步都像是进行一场惊险的跨越。”

  开头还是幸运的。在蛋白培养这个环节上,并没有出现什么令人难以应付的状况。看到研究有了良好的开端,也为了应付后续繁重的研究工作,颜宁老师让党尚宇的同班同学孙林峰加入到课题组中,与党尚宇“搭档”。两个年轻人尝试着培养出了第一批蛋白的晶体。

  下一步,要用X射线对晶体进行衍射分析,如果能够得到满意的图像,基本上离得到蛋白的结构就不远了,所以晶体的好坏是能否解析蛋白结构的关键。

  党尚宇这样形容那个几乎令人沮丧到极点的时候:每颗晶体直径连0.1毫米都不到,用一个肉眼几乎不可见的金属圈小心翼翼地把“晶体”从一个半粒小米大小的液滴中“捞”出来,放到仪器上去衍射,照了几分钟,发现数据情况很不好,再换一颗,还是不好,再换一颗……就这样一直照了一下午,连一组像样的图像都没有得到。两个年轻人很郁闷,常常是辛苦一整天后心情沮丧地离开实验室,回到宿舍闷头大睡、缓冲一下,第二天一大早抖擞精神回来接着干,结果仍然是日复一日的令人心情惆怅。

  到底是什么地方出错了呢?经过反复检查、思考和讨论,党尚宇和孙林峰决定从两个方向入手解决这一问题:一方面继续寻找各种各样的手段去提高蛋白的纯度,二是再变换一些条件去让蛋白更好的结晶。但是仿佛陷入了一个怪圈,晶体衍射后得到的图像一直是没有多大的改观。他们想尽了各种办法、甚至考虑过,是不是要重新来过,换掉大肠杆菌,用其它生物体来培养蛋白,比如昆虫细胞?

  枯燥的实验很容易磨掉人的耐性,在这样的艰难时刻,两个年轻人只有凭借坚强的意志力,才可以坚持下去。
  
  是否可以放弃?

  回答是:坚决不!

  “膜蛋白的研究,某种程度上就是要看谁先放弃!谁先放弃谁就输了,坚持到最后的就赢了。再难的,以前人们认为都是不可能的事情,科学家们都研究出来了,还有什么做不出来的呢?”在这个关键时刻,颜宁鼓励两个年轻人坚持下去,并且一直和他们一起讨论实验结果、讨论下一步实验方案。

  功夫不负有心人!在最初的一段失望之后,晶体衍射的分辨率一点点地提高了。8埃,6埃,4埃(埃是一个长度的单位,在这里埃数越低证明衍射的图像越精确)……进入2009年春天之后,每一次的同步辐射之旅(需要去外地用能量更大的仪器进行同步辐射)都带来了衍射分辨率的提高。

  终于,喜讯在2009年10月份的一天传来:在“捞”了成百上千次蛋白晶体之后,在课题开始之后的第14个月,大肠杆菌岩藻糖转运蛋白的结构终于在人们的面前揭开了神秘的面纱:他们得到的岩藻糖转运蛋白的结构是一个新的向细胞外开放的构象。而之前发现的同类的转运蛋白只有向细胞内开放和中间态的构象。

  这个新发现从结构上验证了人们对转运蛋白转运机理的猜测,也为转运蛋白之后的研究提供了一个参照。看着凝聚着无数心血的弯弯绕绕的蛋白结构,他们俩感觉心里面一下子豁亮起来。

  细节决定成败——解密转运蛋白的生化功能
 
  解开转运蛋白的结构的喜悦没有持续多久,研究工作就再度陷入了僵局——初步分析拿到的转运蛋白的功能,结果就是——没有任何功能!按照设计好的实验步骤,两个小伙子反反复复的做了几遍,都是同样的结果!

  颜宁带领课题组成员一起对实验设计反复琢磨,确认是没有问题的,最后推断:很有可能问题是出在实验某一个环节的操作上。这个时候,颜宁安排在膜蛋白生化研究上相对有经验的、比他们高两级的研究生黄永鉴加入到课题的研究中。

  黄永鉴加入课题研究的第二天,就发现党尚宇和孙林峰在实验操作的时候没有把特定的溶液“洗干净”,而且溶液的初始温度也偏高,就这两个小小的细节,帮助课题组跨过了第一个障碍;改进了这一步之后,实验得到的数据有所改善,但是读数还是偏低,老师同学在一起分析来分析去,最后发现是实验用的一个进口滤膜的实际孔径大于标明的0.22微米,导致出现了“滴漏”,换了一个牌子的滤膜就解决了这个问题。

  在谈到这一状况的时候,颜宁说:“实验的细节往往决定成败,有的学生在做实验的时候小毛病多,有可能做10次但是8次都是错的。这样不仅费时费力,而且对学生本身的心态也是很大的打击。党尚宇他们对待实验的态度非常严谨,所以做实验的成功率很高,科研进展也比较快。”

  “小牛”向前冲——学生就是青年科学家

  “现在对于党尚宇他们来说,再做膜蛋白的结构和功能分析,已经没什么可怕的了,他们已经有充分的自信。在我的心目中他们就是崭露头角的青年科学家。”颜宁很欣赏这两个小伙子。

  在颜宁的心中,这些学生聪明过人,“开窍”早,不过颜宁也补充:希望学生们不要太“乖”,希望学生更活跃,要跟老师在学术上争论,甚至吵得面红耳赤。

  清华大学结构生物学研究中心在过去一年半相继报道了3个新型膜蛋白的4个晶体结构,由于其创新性和重要性,4篇学术论文全部发表于《自然》或《科学》,为我国的膜蛋白结构生物学研究作出了重要贡献,其成果在国际结构生物学领域获得了充分关注。而更加惊喜的是,在这些课题研究的主力军中,都有高年级本科生和低年级研究生的身影——“低龄化”已经成为清华大学结构生物学研究的一个特点。

  他们,不仅是中国科学研究的现在,更是中国,乃至世界科学界的未来。

  ■ 新闻链接

  当静静的坐在我们面前解析这次完整的课题研究过程的时候,党尚宇和孙林峰都提到了思考的重要性。

  党尚宇认为,在运用各项实验仪器的时候,仅仅知道如何去用是不够的,更重要的是要知道为什么要这么做,仪器的原理是什么。惟其如此,才不仅仅能按照老师教的方法去做实验,也可以改进实验方法,甚至可以在符合原理的条件下换另外一种实验方法。

  孙林峰认为,实验的过程一定不要机械性地操作,要不断思考,才能够找到最为合适的实验手段。尤其是在感觉做不下去的时候,更要保持清醒的头脑,不要想当然,回顾一下从课题开始的每一个环节,认真分析其中每个步骤,才能够找到症结所在。(周襄楠 吕露英) 

2010年10月19日 13:06:54  清华新闻网

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